Understanding Peroxidase immobilisation on Bioinspired Silicas and application of the biocatalyst for dye removal

Dyestuff industry is responsible for up to 20% of the industrial water pollution, due to dye loss in effluents. Compared to research on treatment of azo dyes (largest category), research of anthraquinone dyes (second largest category) is neglected. Environmental considerations about industrial chemical processes for water treatment have led to a shift towards green chemistry and biocatalysis. Although peroxidases are vastly applied in bioremediation, they cannot be industrially implemented due to low stability, lack of reusability and difficulty in scale-up. Immobilisation offers reusability and can improve the catalytic functions and operational stability of biocatalysts. Novel approaches, include bioinspired supports, synthesised fast and economically, avoiding the environmentally un-friendly methods used in “conventional” immobilisation. This project focused on understanding the immobilisation of Horseradish Peroxidase (HRP) on bespoke Bioinspired Silicas (BIS), by examining factors affecting the synthesis and performance of the biocatalysts. We immobilised HRP on BIS via in-situ encapsulation and adsorption, and compared the outcomes to that of HRP adsorbed on commercial silicas. We also examined the effect of the controlled presence of amine functionalisation on BIS, of the point of HRP addition during synthesis of the biocatalyst and of increasing HRP concentration, to the immobilisation efficiency and performance of biocatalysts. BIS showed high potential as immobilisation supports, offering high loading (about 20% HRP on BIS-HRP composite) of active enzyme and their ability to protect HRP under exposure to non-optimal conditions. Biocatalysts were characterised for their morphology and porosity before assessing their performance a standard peroxidase assay based on 2,2′-azino-bis(3-ethylthiazoline-6-sulfonate acid oxidation (ABTS assay) and an application assay based on enzymatic degradation of a model anthraquinone dye, Reactive Blue 19 (RB19 assay). Further examination of the best performing BIS-HRP samples, revealed a competitive action of BIS to enzymatic activity, where the support acts as an excellent adsorbent, hindering the diffusion of substrate and product(s) through the pore network. Although free HRP outperforms immobilised HRP (especially via encapsulation), immobilisation results in a highly reusable biocatalyst, for up to 20 times with 60% performance retention towards dye removal, with enhanced storage stability, retaining almost 100% activity over 50 days of storage, compared to 3 days of storage reached with free HRP. Through this work, we showed the importance of individual factors crucial for enzyme immobilisation, regarding both biocatalyst synthesis and expected performance, as well as the importance of the combination of enzyme, substrate and immobilisation support on biocatalyst performance. This work can be a great base for further optimisation of BIS as enzyme immobilisation support, and its exploration in other applications in the area of water treatment

Antimicrobial character of natural agents and impact of sources of dietary fibers embodied in fresh pasta

231 σ.Η παρούσα διπλωματική εργασία είχε δυο αντικείμενα μελέτης. Μελετήθηκε η ενσωμάτωση φυσικού αντιμικροβιακού παράγοντα σε φρέσκα ζυμαρικά είτε απευθείας, είτε σε εγκλεισμένη μορφή σε διαφόρους φορείς, με παράλληλη εξέταση των αντικειμενικών και οργανοληπτικών χαρακτηριστικών των ζυμαρικών. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της προσθήκης πηγών διαιτητικών ινών σε φρέσκα ζυμαρικά, όσον αφορά τα αντικειμενικά και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά τους. Τα αντικειμενικά χαρακτηριστικά των φρέσκων ζυμαρικών που εξετάστηκαν ήταν το επιφανειακό χρώμα (σε κλίμακα L, a, b), η υφή (σκληρότητα), η ενεργότητα του νερού, οι μικροβιολογικές παράμετροι (ολική μικροβιακή χλωρίδα και σύνολο μούχλων και μυκήτων) και τα χαρακτηριστικά βρασίματος (δείκτης διόγκωσης, δείκτης απορρόφησης νερού και δείκτης απώλειας μάζας κατά το βράσιμο), κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Όλα τα δείγματα συσκευάστηκαν και αποθηκεύτηκαν υπό ψύξη για χρονικό διάστημα 8 ημερών. Το φυσικό αντιμικροβιακό που μελετήθηκε ήταν εκχύλισμα κορίανδρου, σε μορφή ελαιορητίνης. Οι φορείς εγκλεισμού που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αραβικό κόμμι, συνδυασμός αραβικού κόμμεος και τροποποιημένου αμύλου και συνδυασμός τροποποιημένου αμύλου και χιτοζάνης. Οι πηγές διαιτητικών ινών που μελετήθηκαν ήταν ινουλίνη, πίτουρο βρώμης και απομονωμένες ίνες καρότου. Από τα πειραματικά αποτελέσματα αποδείχθηκε πως το φυσικό αντιμικροβιακό λειτουργεί θετικά παρέχοντας προστασία ως προς τις μικροβιακές αλλοιώσεις (ολική μικροβιακή χλωρίδα, ζύμες – μούχλες) των φρέσκων ζυμαρικών κατά την αποθήκευσή τους υπό ψύξη. Η ενσωμάτωση της ελαιορητίνης απευθείας στα δείγματα αποδείχθηκε ότι έχει ελαφρώς καλύτερη προστατευτική δράση από ότι η εγκλεισμένη μορφή της σε φορέα, ενώ η ποσότητα ενσωματωμένης ελαιορητίνης δεν φάνηκε να παίζει σημαντικό ρόλο στην αντιμικροβιακή δράση του κορίανδρου. Η σκληρότητα των δειγμάτων με απευθείας ενσωμάτωση ελαιορητίνης αυξάνεται ελαφρά κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, ενώ στα δείγματα με ενσωμάτωση εγκλεισμένης ελαιορητίνης η σκληρότητα παραμένει σχετικά σταθερή. Η φωτεινότητα και το ολικό χρώμα της επιφάνειας των δειγμάτων επηρεάζονται σε μικρό βαθμό από την ενσωμάτωση της ελαιορητίνης. Η ενεργότητα του νερού των δειγμάτων παραμένει σχεδόν αμετάβλητη κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, με τιμές όμως χαμηλότερες από αυτές του τυφλού δείγματος. Οργανοληπτική εξέταση των διαφόρων χαρακτηριστικών των φρέσκων ζυμαρικών με ενσωμάτωση ελαιορητίνης κορίανδρου, σε αυτούσια ή σε εγκλεισμένη μορφή, έδειξε πως το γευστικό προφίλ τους επηρεάζεται έντονα στις πρώτες ημέρες αποθήκευσης, ενώ η αρωματική επίδραση της ελαιορητίνης μειώνεται κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Σε συνολικό επίπεδο εξέτασης, προτιμώμενος τρόπος ενσωμάτωσης της ελαιορητίνης κρίθηκε η εγκλεισμένη μορφή της σε φορέα και προτιμώμενος φορέας εγκλεισμού κρίθηκε ο συνδυασμός αραβικού κόμμεος και τροποποιημένου αμύλου. Όσον αφορά τα αποτελέσματα των χαρακτηριστικών βρασίματος των δειγμάτων με προσθήκη πηγής διαιτητικών ινών, ο τύπος της πηγής ινών αποδείχθηκε πως επηρεάζει τα χαρακτηριστικά αυτά του προϊόντος, σε αντίθεση με το ποσοστό προσθήκης αυτής, ενώ οι τιμές των χαρακτηριστικών διατηρούνται αναλλοίωτες κατά τη διάρκεια αποθήκευσης. Η σκληρότητα των δειγμάτων επηρεάζεται από το είδος της ενσωματωμένης ίνας και αυξάνεται κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Η φωτεινότητα και το ολικό επιφανειακό χρώμα των δειγμάτων επηρεάζονται από το είδος της ίνας, αλλά οι τιμές τους διατηρούνται σχετικά σταθερές κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης. Ο τύπος της ενσωματωμένης ίνας επιδρά και στην ενεργότητα του νερού των δειγμάτων, η οποία όμως διατηρείται σε σταθερά επίπεδα κατά την αποθήκευση. Οργανοληπτική εξέταση των διαφόρων χαρακτηριστικών των δειγμάτων με ενσωματωμένες πηγές διαιτητικών ινών έδειξε σημαντική επίδραση τόσο του είδους της ίνας όσο και του ποσοστού ενσωμάτωσης. Σε συνολικό επίπεδο εξέτασης, προτιμώμενο δείγμα κρίθηκε αυτό με προσθήκη απομονωμένων ινών καρότου σε ποσοστό 7.5%.In the present thesis, two subjects were studied. The first one was the incorporation of a natural, antimicrobial agent in fresh pasta samples, which was added directly to the dough, or after being encapsulated in various carriers and its effect on the objective and sensorial characteristics. The second subject studied was the effect caused by the incorporation of sources of dietary fibers into pasta samples, concerning their objective and sensorial characteristics. The objective characteristics studied were surface color (in the L, a, b system), texture (hardness), water activity, microbial parameters (total microbial flora and total colony number of molds and fungus), as well as boiling parameters (swelling index, water absorption and cooking loss), during the storage of the samples. Every sample was packaged and stored refrigerated for 8 days. The natural antimicrobial agent used was coriander oleoresin. The carriers of encapsulation were arabic gum, mixture of arabic gum along with modified starch and mixture of modified starch along with chitosan. Concerning the sources of dietary fibers used, they were inulin, oat bran and isolated carrot fiber. From the experimental results it was proved that the antimicrobial agent incorporated into fresh pasta samples acts protectively towards microbial deterioration, during storage of the samples refrigerated. Incorporation of oleoresin directly into pasta showed better results concerning microbial protection than oleoresin encapsulated into carriers, as well as the quantity of oleoresin appeared to have no significant effect on the protection of pasta towards microbial deterioration. Hardness of samples with addition of non encapsulated oleoresin increases slightly during storage, while hardness of samples with encapsulated oleoresin remains steady. Concerning the color parameters, both luminosity and surface color of the samples are slightly affected by the oleoresin incorporation, while water activity values of the samples remain steady but lower than these of the blind sample. Analysis of the sensorial characteristics of fresh pasta samples with incorporation of coriander oleoresin in straight or encapsulated form showed that the flavor profile of the samples is more strongly influenced during the first days of storage, while the aromatic influence of oleoresin does weaken during storage. At an aggregate level of study, preferable way of incorporation of oleoresin into fresh pasta samples was the encapsulation, using as carrier a mixture of arabic gum along with modified starch. Regarding the second object studied in this thesis, results concerning the three boiling parameters of samples with incorporation of sources of dietary fibers showed that the source of fiber affects those parameters, while the percentage of fiber added does not seem to affect. Hardness of samples is also affected by the source of fiber, and in general its values rise during storage. Both color parameters and water activity are affected by the type of the fiber, but the values of those parameters are kept stable during storage. Analysis of the sensorial characteristics of fresh pasta samples with added sources of dietary fiber showed that both the type of fiber as well as the percentage of addition had a significant impact. At an aggregate level of study, preferable source of fiber was the isolated carrot fiber, when added at a percentage of 7,5%.Ελένη Α. Ρούτουλ